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中南大学学报发布了「基因治疗与阿尔茨海默病」一文，现整理如下，供大家参考学习。

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种进行性的神经退行性疾病，临床上表现为记忆和认知功能障碍，语言和行为能力缺失，患者后期表现出严重的失忆症和运动功能减弱，最终导致死亡。德国神经病学家 Alois Alzheimer 1906 年首次报道了 AD，近些年来，AD 发病率在逐年增高，美国 65～75 岁老人中 20% 患有 AD。2010 年全球 AD 患者约有 3500 万，到 2050 年将达到 1.15 亿。由于血脑脊液屏障的存在，很多药物难以进入神经系统组织内，导致传统药物治疗 AD 受到很大限制。

随着对 AD 研究的深入，基因治疗引起了人们的重视，基因治疗是向功能缺陷或者病变细胞转入互补的正常基因或治疗性功能基因而达到治疗目的。常规治疗方法是针对疾病的各种症状，而基因治疗则是针对疾病的根源一异常基因的本身。因此，目前载体介导的转基因治疗技术激发了医学研究者极大的兴趣，也为治愈 AD 带来了新的希望。

AD 基因治疗的载体

基因治疗成功的主要障碍在于缺乏合适的转基因载体，临床应用的载体应具备以下特征：低细胞毒性/免疫原性、高转染效率、高组织特异性和较低的合成成本。对于 AD 基因治疗的载体，应该能顺利通过血脑屏障并对脑组织具有高组织特异性和转染效率。目前 AD 基因治疗的载体主要分为两大类：非病毒载体和病毒载体，但没有一种载体同时具备这些特征。

1. 非病毒载体

（1）脂质体：脂质体是一种脂质囊泡，脂质体可将治疗基因封装于脂质体亲水的内核中，可通过细胞膜的内吞作用和/或细胞膜的直接融合作用将目的物质运输入胞内。近年来常用脂质体 2000 作为基因载体，较病毒载体而言，其具有安全性高、免疫原性小、毒性小和容易制备等优点，已成功应用于很多细胞实验及动物体内试验，但缺点是靶向转染效率较低。

（2）阳离子多聚物：阳离子多聚物表面的正电荷可与带负电的治疗基因形成带正电荷的复合物，该复合物通过静电作用吸附于细胞表面，通过细胞内吞作用将基因导入细胞并获得表达。Liang 等利用载有相应 siRNA 的聚乙二醇-聚乙烯亚胺（PEG-PEI）多聚纳米粒子转染神经干细胞，该靶基因被抑制，当 PEG-PEI 中氮含量与 siRNA 中磷含量的比值为 15 时，与脂质体 2000 相比有较高的转染效率和较低的细胞毒性。非病毒载体可以转染各种细胞，主要优点是操作方便，其主要缺点在于对于一些难转染的细胞系，效率较低，如特异性转染到脑组织的文献未见报道。

2. 病毒载体

（1）慢病毒载体是指以 HIV-1 为来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，能够转染非分裂细胞和分裂细胞。可有效地转染神经元、肝细胞、肿瘤细胞、干细胞等多种类型细胞。Mazarakis 等为提高载体的靶向性，利用狂犬病毒的糖蛋白能与神经节突触后膜表面的乙酰胆碱受体靶向结合并逆向轴浆运输转染神经细胞的特点，把载有狂犬病毒的糖蛋白基因和有慢病毒载体的治疗基因结合治疗中枢神经系统疾病，发现与其他病毒载体相比，其转染神经细胞效率更高。

（2）腺相关病毒载体（adeno-associated virus vectors，AAV）是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。腺相关病毒是简单的非致病性单链 DNA 病毒，需要辅助病毒参与生命周期，辅助病毒通常为腺病毒（adenovirus，Ad）或者单纯疱疹病毒。AAV 具有嗜神经性，可高效地将一个或多个外源基因转入脑组织进而转染神经细胞，并且无致病性，也不会干扰脑的正常生理功能。

AAV 还有定点整合能力，当不存在辅助病毒时就会以潜伏感染的形式 整合到 19 号染色体（q13.4）长 4.0 kb 的 AAV S1 区域中，通常不会引起宿主基因的插入突变。重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus vectors，rAAV）源于非致病的野生型腺相关病毒，经过十几年的研究，rAAV 的生物学特性已被深入了解，由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

（3）腺病毒载体是一类无包膜的线状双链 DNA 病毒载体，感染细胞时不能将其 DNA 整合到宿主基因组中，Ad 在感染细胞后成为游离状态保存在细胞核内。Ad 载体通常会引起宿主的免疫反应，导致其载体被免疫应答所清除。为了减弱这一免疫反应人们构建了多种重组腺病毒载体，Eto 等将聚乙二醇化的 Ad 载体转入小鼠体内，发现其产生的抗 Ad 抗体 IgG 和 IgM 要明显低于未经修饰的 Ad 载体。

上述病毒载体是将基因构建到病毒载体上，通过病毒包装等步骤形成活性的病毒颗粒，颗粒内部有目的基因，外壳为病毒蛋白，以病毒感染的方式将基因传递到细胞内部，所以效率很高。慢病毒载体适合稳定转染，腺病毒载体适合瞬时转染，各有优势，缺点是构建和纯化比较困难。

AD 基因治疗策略

AD 的确切发病机制尚不明确，目前认为是老化、遗传和环境多种因素的共同结果。有多种学说，其中影响较广的是?β? 类淀粉样蛋白（β amyloid peptide，Aβ）学说，也有其他假说如遗传假说、氧化应激假说、微循环障碍假说、胆碱能假说以及胰岛素学说和基因学说等。

随着对 AD 分子发病机制的不断了解，在 AD 的治疗研究上也取得了显著的成效，某些药物已进入临床试用阶段。基因治疗也是常用的治疗 AD 的方法，这种方法是用基因重组把基因不断的进行替换的治疗方法，可有效的防止中枢神经出现损害，对学习和记忆功能都有所改善。AD 基因治疗的策略有基因失活、基因修饰、免疫调节等。

1. 基因失活

基因失活是指利用反义技术特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。目前该策略主要用于减少脑内 Aβ 的生成。

（1）抑制 APP 的生成：淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）的基因位于人类 21 号染色体长臂上，是一种在多种组织中表达的膜内在蛋白，可能参与调控突触的形成、神经元的可塑性和铁的外向转运，但其主要功能尚不明确，经过 β-分泌酶和 γ-分泌酶切割生成 Aβ。

Hong 等利用表达有短发卡 RNA（short hairpin RNA，shRNA）的单纯疱疹病毒载体转染体外培养的神经元，发现 shRNA 使 APP 基因转录过程中的 mRNA 降解，从而减少了 APP 的生成，此外在 AD 小鼠模型中也检测到了 APP 及 Aβ 含量的降低。

（2）抑制产生 Aβ 的分泌酶：APP 经过非淀粉样生成途径和淀粉样生成途径进行分解代谢，在非淀粉样生成途径中，APP 相继经过 α-分泌酶和 γ-分泌酶作用生成可溶性 APP 胞外结构域、APP 胞内结构域和 p3-肽；在淀粉样生成途径中，APP 相继经过 β-分泌酶和 γ-分泌酶的作用生成可溶性 APP 胞外结构域、APP 胞内结构域和 Aβ，Aβ 聚集形成寡聚体沉积在细胞外形成淀粉样斑块。因此 β-分泌酶和 γ-分泌酶基因可以作为基因失活的两个靶点。

淀粉样前体蛋白 β 位分解酶 1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）是 β-分泌酶的一种，BACE1 基因敲除杂合小鼠 Aβ 聚集明显减少，也未发现神经元缺失和记忆功能障碍等 AD 相关的病变。Li 等利用载有 siRNA 阳离子多聚物转染 SK-N-SH 细胞，BACE1 的表达量下降至对照组的 49% ± 8%。

γ-分泌酶是膜内切割蛋白酶家族的成员，由 4 个亚基组成，它们分别为 presenilin，nicastrin，anterior-pharynx-defective-1 和 presenilin enhancer-2，其中 presenilin 是催化亚基，有切割底物的功能。Kandimalla 等在 IMR-32 细胞内利用 RNA 干扰技术沉默 presenilin 基因，结果 γ-分泌酶的活性降低，Aβ 的含量也明显降低。

2. 基因修饰

基因修饰是将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强，在这种方法中，缺陷基因仍存在于细胞内，目前基因治疗多采用基因修饰，其中以脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和脑啡肽酶（neprilysin，NEP）基因的应用较为广泛。

（1）BDNF 基因的应用：BDNF 是体内含量最多的神经营养因子，在维持胆碱能神经元的活性、促进神经细胞的分化和再生、提高突触的可塑性和学习记忆能力等方面有重要作用。AD 患者海马区 BDNF mRNA 表达量明显减少，在发病过程中神经元的丢失至少一部分是由于一种或多种神经营养因子的缺乏所致。Boiocchi 等使用载有 BDNF 基因的慢病毒载体注入到 J20 转基因小鼠内嗅区皮层，和对照组相比，实验组小鼠的认知、学习和记忆功能得到显著改善。

（2）NEP 基因的应用：NEP 是一种质膜糖蛋白，是脑内最主要的 Aβ 降解酶，在 AD 患者脑内特别是 Aβ 负载区域 NEP mRNA 和蛋白质水平都显著降低。Spencer 等应用慢病毒载体介导的 NEP 注入?APP 转基因小鼠双侧大脑半球，治疗 6 个月后发现，APP 转基因小鼠脑皮质区 Aβ 较对照组减少了 48%，并且小鼠的行为和认知功能得到显著改善。

然而如果治疗基因需要转运至大脑广泛区域，这种立体定位注射病毒载体的方法就不再适用，Iwata 等开发出一种重组腺相关病毒载体 rAAV9，可以通过心内注射到 APP 转基因小鼠，经过血液循环到达脑内广泛表达，发现 Aβ 聚集减少，在水迷宫实验中检测到小鼠的认知障碍得到改善。

3. 免疫调节

免疫调节是指将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内，改变免疫状态从而达到预防和治疗疾病的目的。Aβ 级联假说认为脑内?β? 淀粉样蛋白代谢异常造成的 Aβ 片段聚集引发的级联反应是 AD 的主要致病因素，由此越来越多的研究者开始专注于 Aβ? 疫苗的研究。

Schenk 等在 PDAPP 转基因小鼠中每月接种含有佐剂的 Aβ，发现在小鼠体内出现了高滴度的 Aβ 抗体，并且明显减少了 Aβ 在脑内的聚集。根据这些研究成果，在 2001 年研制的 Aβ 疫苗 AN1792 应用于临床实验，但是接受该疫苗的患者 6% 出现了脑膜脑炎，其原因可能是产生了 TH1 型细胞免疫反应，致使该疫苗 Ⅱ?A 期的临床实验在 2003 年被迫停止 。

近来人们开始关注 DNA 疫苗，DNA 疫苗具有安全性好、成本低、纯化方便等优点。Matsumoto 等设计了一种针对多种 Aβ 片段的 DNA 疫苗 YM3711，免疫后的 Tg 小鼠脑内 Aβ1-42、AβpE3-42、Aβ 寡聚体和 Aβ 纤维明显减少，同时检测 Tg 小鼠大脑皮层和海马区均未发现有 T 细胞浸润，这一结果表明，重复使用 YM3711 疫苗并没有引起小鼠的神经炎症，因此 YM3711 疫苗值得在临床前和临床实验中进一步验证。

展望

尽管基因治疗在 AD 细胞模型和动物模型中取得了一定的效果，但要在临床上应用推广尚需做深入研究。目前制约基因治疗发展的因素主要有以下几个方面：

1. AD 的确切发病机制不清楚，进一步加强对 AD 病理生理、分子生物学机制的研究，为基因治疗提供准确的治疗靶基因，不仅能改善 AD 的临床症状，还有望从根本上治愈 AD；

2. 非病毒载体和病毒载体各有优缺点；

3. 作用于 Aβ 生成和清除的酶不具有专一性，还可以作用于一些其他底物，如催化 Aβ 产生的 γ-分泌酶还可以切割 Notch，产生的膜内片段可以通过 Notch 信号传导途径参与核内信号转导，进而调节生长发育，如抑制 γ-分泌酶可能会影响生长发育；

4. 敲除 BACE1 的 AD 小鼠脑内 Aβ 减少，但正常小鼠敲除 BACE1 会出现感觉运动能力、空间记忆能力衰退；

5. NEP 底物众多，长期过度上调 NEP 水平或活性可能会影响正常生理功能，研究人员在果蝇实验中就发现过表达 NEP 会减少 cAMP 反应元件结合蛋白介导的转录，但其对于人体的影响还有待进一步研究，所以要寻找专一性的靶基因，以减少基因治疗的不良反应。

随着基因组计划的完成，AD 发病机制的进一步阐明和更加有效的靶基因的发现，基因治疗必将成为治疗 AD 的一种有效途径。

注：本文由李建、李闻文、周军制定，发布于《中南大学学报》2015 年第 40 卷第 4 期。

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