读医学网

文章作者：陈颖 罗长青

众所周知，慢性肾脏疾病已成为全世界范围内重要的公共卫生问题。一般认为，肾小球硬化和肾小管间质纤维化是慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路。

足细胞又称为肾小球上皮细胞，其足突为肾小球滤过屏障的重要组成部分。近10余年来的研究已证实，足细胞损伤是肾小球硬化的初始事件。

同型半胱氨酸(homocysteine，Hey)是甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，本身并不参加蛋白质的合成。

Eikelboom等研究表明，髙同型半胱氨酸血症(homocysteine，hHcy)可引起内皮功能受损、血栓形成、胆固醇和甘油三酯合成代谢的紊乱以及单核细胞的活化，从而参与硬化性疾病，包括肾小球硬化的发生和发展。

有以下证据支持ESRD患者患有高同型半胱氨酸血症；高同型半胱氨酸血症是尿毒症心血管并发症发病机制的一个关键因素；肾功能正常患者中尿白蛋白排泄率与总同型半胱氨酸水平相关。

由于足细胞损伤为肾小球硬化的初始事件，笔者将对hHcy与足细胞损伤的分子机制和致病机制进行简要介绍。

一、高同型半胱氨酸血症概述

血浆中Hey以结合形式或游离形式存在，结合形式有3种类型，即白蛋白-同型半胱氨酸二硫化物、自身结合成二聚物Hey或与其他硫醇化合物结合形成异二聚体，约占70%?80%。

由于常规实验室检测并不区分Hey存在的形式，因此血浆Hey水平一般指总Hey含量。正常空腹情况下，血浆中Hey浓度为5?15fxmol/L，高于此范围便称为hHcy(15?30ponol/L为轻度，30?100^mol/L为中度，大于100ftmol/L为重度)。

体内Hey代谢途径有以下几种方式:①Hey在甲硫氨酸合成酶作用下，同时维生素玖2作为辅助因子，以N5-甲基四氢叶酸为甲華供体，重新合成甲硫氨酸；在亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)作用下，以维生素氐为辅酶，催化N5，N10甲基四氢叶酸形成N5-甲基四氢叶酸，并参与Hey再甲基化；

②Hcys在甜菜碱-高半胱氣酸甲基转移酶(BHMT)参与下，以甜菜碱为甲基供体，再次生成甲硫氨酸及二甲基甘氨酸；

③Hey在胱硫酿合成酶(CBS)作用下，以维生素Rs为辅助因子，与丝氨酸缩合成胱硫醚，胱硫醚又在7腕硫醚酶作用下裂解为半胱氨酸，最后形成丙酮酸、硫酸和水。

影响体内Hey浓度的因素主要有以下几个方面:①遗传因素，为Hey代谢过程中某些关键酶基因突变或者活性受损所致，如MTHFR的基因或参与甲基化的合成酶及CBS基因缺陷等；

②营养因素，叶酸、维生素氏、维生素氏2等维生素作为辅助因子可影响Hey代谢，缺乏可导致Hey升高；

③性别、年龄及疾病等因素，Hey浓度可随着肾功能损伤及老年化而升高，且男性高于女性。

因此，经典的hHcys模型的制作方法是用含Hcys、甲硫氨酸，不含叶酸、VitB12、VitB6的特殊饮食喂养实验对象。

二、hHcys导致足细胞损伤

Huber等人的研究表明nephrin和podocin等裂孔隔膜相关分子有利于足细胞极性的调节，在足细胞存活及细胞骨架方面具有重要的作用。

此外，Mundel等人的研究证实，在分化的足细胞中存在可以媲美平滑肌细胞或者周细胞的细胞骨架。因此，裂孔隔膜相关分子表达的减少及细胞骨架蛋白actin的表达紊乱均可引起足细胞的损伤。

在hHcy大鼠模型中，随着Hey水平的升髙，大鼠的尿白蛋白分泌率、肾小球损伤指数逐渐升高。同时随着hHcy的时间延长(0?6周），裂孔隔膜相关分子（如nephrin和podocin)表达被抑制，而细胞骨架蛋白actinin-4的表达却逐渐升高。由此初步明确hHcy可直接导致足细胞损伤并进一步诱导肾小球硬化的发生和进展。

三、hHcy导致足细胞损伤及肾小球硬化的机制

Shah等的研究表明氧化应激参与了许多慢性炎性疾病，包括慢性肾脏疾病的发生发展。人体内存在活性氧(ROS)与抗氧化系统，两者之间的失衡可导致氧化应激的发生。

ROS是一类氧衍生的小分子，包括超氧阴离子(Of)、过氧化氢(H2a)、羟自由基(OH)、次氣酸(HOC1)及各种脂质过氧化反应的产物等。

线粒体偶联的酶、细胞色素P450、黄嘌呤氧化酶（xan-thineoxidase)及NADPH氧化酶（NADPHoxidase，NOX)均能产生ROS。

但是不同于其他酶，产生ROS为NADPH氧化酶的主要功能而且肾皮质中ROS主要来源于NADPH氧化酶。

吞噬细胞中的NADPH氧化酶由催化亚基gp91phox(NOX2)和调节亚基p22ph构成。该二聚体受到一些主要位于的胞浆的蛋白（如p47phox、p67phox、p40ptal及Rac蛋白调节。

非吞噬细胞型中存在6种在结构与功能上都与吞噬细胞gP91phra(NOX2)同源的蛋白，即NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOXl和DUOX2，除NOX5及DUOX可为Ca2+直接激活外，其余均需P22—1辅助。

上述蛋白组成了NOX家族。NADPH氧化酶组装并激活后即可产生ROS，参与氧化还原信号转导。Greiber等最早在人足细胞中发现了NADPH氧化酶亚基，包括p67phM。

Whaley-Connell等进一步证实小鼠足细胞中组成性表达NOX2、NOX4、p22phM、p47phox、Racl。

1.NADPH氧化酶介导的氧化还原信号介导了hHcy诱导的足细胞损伤

以敲除gp91phox(gP91-/-)基因的小鼠作为实验组（KO)，野生型（gP91+/+)小鼠作为对照组(WT)，并同时制作hHcy模型。

实验结果表明，在相同的Hey水平下，相较于野生型小鼠，gP91-/-小鼠的O2-产物的产生明显减少，蛋白尿和肾小球损伤指数(GDI)显著降低，肾小球滤过率（GFR)更高。

此外hHcy导致了野生型小鼠n印hrin的表达减少及desmin的表达增多，而这一点在gp917小鼠中不明显。形态学上，gP91-/-小鼠中，hHcy导致的足突的融合以及足突细胞的缺失明显减少。

体外研究显示，Hcys可以提高足细胞gp91phox的表达以及O2-的产生，而这一过程可以为gp91ptolsiRNA或者NADPH氧化酶抑制剂(DPI)所阻断。进一步功能学研究发现，Hcys对VEGF的诱导性减少和足细胞骨架的破坏亦可以为gp91plrasiRNA或者DPI所阻断。

这些研究结果提示，肾脏局部NAD~PH氧化酶的激活是Hey诱导足细胞损伤和肾小球硬化的重要分子机制。

2.hHcy激活NADPH氧化酶的分子机制-脂筏(lipidraft，LR)聚集

LR是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，大小约70ran左右。由于鞘磷脂具有较长的饱和脂肪酸链，分子间的作用力较强，因此这些区域结构致密，介于无序液体与液晶之间，称为有序液体。在低温下这些区域能抵抗非离子去垢剂，所以又称为抗去垢剂膜。

在各种因素刺激下，脂筏中的鞘磷脂可被酸性鞘磷脂酶(ASM)水解，从而释放出亲水性的碑酸胆碱基团，并生成具有疏水性的神经酰胺。

神经酰胺具有自发集聚的特性，能将细胞膜上众多的小脂筏簇聚成更大的膜区段，即神经酰胺富含区域。这一区域将成为一个很好的信号转导平台，便于活性酶复合体的形成，从而易化或放大包括氧化还原信号转导在内的众多跨膜信号的转导。

将进行单侧肾切除后的ASM基因敲除（ASM-/-）小鼠、野生型小鼠分别进行或不进行ASMshRNA转染，并制作hHcy模型。

体内分子成像技术显不，从第3天开始，转染的shRNA在肾皮质中表达并持续了24d。hHcy刺激下，相对于ASM-/-小鼠或shRNA转染后的野生型小鼠，ASM+/+小鼠肾皮质酸性鞘磷脂酶的表达，ASMmRNA的表达及活化，NADPH依赖的超氧化物的产生均显著地增多。

同时免疫荧光分析显示ASM+/+小鼠肾小球中的podo-cin的表达减少而desmin及神经酰胺水平升高。这一点并未在ASM-r小鼠或shRNA转染后的野生型小鼠中观察到。

共焦显微镜显示，hHcys刺激下NADPH氧化酶的亚基gP91phox和p47phox可以在脂筏(LR)簇上聚集。这一点亦为脂夜的浮选分离所证明。

不同机制的LR破坏物（甲基化-β环糊精(MCD)或非律平菌素（filipin))均可以抑制gP9lph0X和p47ph?的数目及活性以及LR-gp9l—和LR-p47ph?跨细胞膜信号传导复合物的形成，进而保护了足细胞。

由此，脂筏-氧化还原信号转导平台的形成是Hey激活NADPH氧化酶活性的重要分子机制。

3.NADPH氧化酶活化后继发的反应-NALP3炎症小体

(1)hHcys诱导炎症小体的产生

NALP3炎症小体是一种在炎症过程中起到“开关”作用的多蛋白复合物，RT-PCR和Westernblot表明小鼠足细胞表达的NALP3炎症小体有3个必要的组成部分，即NALP3、ASC和caspase-1。

在hHcy动物模型中，通过共焦显微镜及分子排阻色谱在早期即检测到肾小球足细胞中NALP3炎症小体的形成及活化，白细胞介素-1产物的增加。而肾脏ASC基因的局部沉默可以显著减轻这一过程。

在病理上，hHcy相关的蛋白尿、肾小球足细胞足突融合，足细胞裂隙膜相关分子的丢失及后期的肾小球硬化亦可以因ASC基因的局部沉默或capas-l抑制剂显著恢复。

体外研究也得到了类似的结论。总之，NALP3炎症小体的形成和活化是hHcy介导的足细胞损伤及最终肾脏硬化的重要分子机制。

(2)NADPH氧化酶激活在hHcy诱导炎症小体活化中的作用

在hHcy动物模型中，gp9lphox-/-大鼠和gp9lds-tat大鼠炎症小体的形成及活化显著减少，并伴有蛋白尿、白蛋白尿以及肾小球硬化性改变的减少。

在体外，共焦显微镜以及分子排阻色谱法显示，在NADPH氧化酶抑制剂的作用下，足细胞中的NALP3炎症小体，特别是caspasel和白细胞介素-邛的活化减少，NALP3、ASCXcaspasd的聚集显著降低。从而进一步阻碍了巨噬细胞和T细胞向肾小球内渗透。

因此，Hey诱导NADPH氧化酶的活化，再进一步引起了“下游反应”-NALP3炎症小体的形成和活化并最终导致足细胞内免疫细胞的趋化、募集以及最终肾小球损伤和硬化。

四、hHcy的治疗

1.丝氨酸蛋白酶抑制剂及NADPH氧化酶抑制剂

丝気酸蛋白酶抑制剂[如甲横酸卡莫他特(CM)]以及NADPH氧化酶抑制剂[如apocynimDPI及4-(2-氨乙基)苯横酰氟盐酸盐(4-(2-Aminoethyl)benzenesul-fonyl fluoride hydrochloride，AEBSF)下对hHcy动物模型的良性作用已经得到证实，目前进一步的研究有待开展。

2.NADPH氧化酶亚基的选择性抑制剂

Vendrov等已经证明NOX1和NOX4的特异性抑制剂GKT136901可以使得动脉粥样硬化性病变中的ROS生成减少并进一步抑制动脉粥样硬化的形成。

目前，具有良好口服生物利用度的GKT136901已被研发出来，为这一类疾病提供了潜在治疗的可能。然而目前该抑制剂尚无明显的足细胞保护效应。

3.生长激素（Growth hormone，GH)及LR破坏物

Li等的研究发现，电子自旋共振谱法显示，Hcys经由NAI PH氧化酶诱导的超氧化物可显著地为GH所抑制(66%)。

25ng/mL的GH预处理足细胞可以减少足细胞的上皮-间质转化。这与LR上NADPH氧化酶亚基可以和GH受体聚集，而GH可以阻断这一过程有关。

同时LR破坏物可阻断NADPH氧化酶的活化。因此生长激素、LR破坏物及相应的高选择性的类似物可能作为以后的研究方向。

此外，由于经典的hHcy动物模型的制作均基于无叶酸饮食，叶酸饮食是否可以治疗hHcy及其引起的肾脏和心血管疾病存在争议。

学者认为，轻度hHcy是动脉粥样硬化的独立危险因素，Scorsatto等在巴西妇女中做的一个调查表明，食用叶酸强化面粉可以降低Hey水平，且《Preventivehealthcare(2000)》建议对hHcy进行筛查和建档来预防冠心病。

然而，也有学者认为叶酸的疗效并不显著。Jardine等通过随机对照试验的Meta分析结论表明，降低Hey的治疗并不会减少慢性肾脏疾病患者心血管事件的发生。

Cotlarciuc等研究显示叶酸降低血桨Hey水平的实际效果与遗传因素关系密切。因此，关于叶酸饮食的疗效尚无定论，叶酸相关的基因靶向治疗可能为今后发展的思路。

五、总结与展望

上述研究表明，hHcy可直接引起足细胞损伤进而导致肾小球硬化，而脂筏簇集继发的NADPH氧化酶激活及NALP3炎症小体的形成和活化是hHcy所致足细胞损伤的关键分子机制。如何合理控制Hey水平以及靶向性阻断hHcy导致的肾脏损害将是亟待解决的关键问题。

临床肾脏病杂志2014年2月第14卷第2期