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文章作者：王芳 丁凯阳

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL)是恶性淋巴瘤中最常见的一型，随着利妥昔单抗的应用，DLBCL的预后越来越好，但仍有一半以上的患者预后较差。

国际预后指数（IPI)是临床上最常用的预后评分系统，但对具有个体差异患者的预后预测不完全可靠，而基因表达谱（GEP)可在分子水平将DLBCL分为生发中心B细胞（GCB)、活化的外周血B细胞（ABC)和第3型(type3)亚型。

目前，基因芯片技术实际应用受到各方面限制，越来越多的免疫组织化学技术（IHC)被用来模拟基因芯片进行DLBCL分类，同时新的分子标志物如微小RNA(miRNA)和外显子测序显示的突变基因对DLBCL的诊治和预后也有重。

1 DLBCL的GEP分类

DLBCL由超过1000个基因构成不同亚型，基因表达谱有助于对DLBCL进行具有生物学意义和预后相关亚型的分类。

Alizadeh等首次应用cDNA阵列，又称淋巴芯片，通过对42例DLBCL患者基因表达谱的分析，在分子水平将DLBCL分为两大亚型：部分DLBCL病例表达GCB标记的系列基因；

而其他DLBCL病例表达体外丝裂原刺激ABC标记的系列基因，GCB亚型预后好于ABC亚型（5年生存率分别为76%和16%)，尽管后来利妥昔单抗的使用明显改善了ABC亚型的预后，ABC亚型对利妥昔单抗的反应仍不iHGCB亚型。

Rosenwald等使用一种类似的cDNA淋巴芯片微阵列对240例以蒽环类为基础化疗的DLBCL进行分析，也得出结论GCB亚型预后好于ABC亚型，同时仍有17%~40%的DLBCL无法用细胞起源来分型，被称为type3，其特性介于GCB和ABC之间。

该分类的临床作用也十分明确，GCB亚型的预后较好（5年生存率达60%)，而ABC亚型5年生存率为35%,type3则为39%。

部分学者认为此亚型不能作为独立的类型存在，但type3也是异质性的，其预后与ABC亚型组无明显差异，并且ABC亚型与type3预后相似且明显差于GCB亚型，故在Hans免疫组织化学分析中type3与ABC亚型被归为一类统称为非生发中心亚型（non-GCB)。

由于以上GEP技术需要新鲜冷冻组织而临床应用受限，Barrans等对172例甲醛溶液固定、石蜡包埋（FFPE)的标本进行RNA提取从而对DLBCL进行GEP分类，可将DLBCL分为GCB、ABC和type3亚型，该方法具有高度的可重复性和可靠性，同时该研究发现ABC亚型预后最差，并且在大量的生存模式中发现仅年龄和GEP亚型对预后起重要作用，而这种关系在免疫组织化学分类时没有体现，研究发现年龄和各亚型间有明显的关联，各亚型的中位年龄分别为ABC型72.8岁、GCB型68.4岁和type3型64.5岁，年龄大的ABC亚型患者预后极差，该研究证实可以对FFPE标本进行GEP分类，从而在医学试验和临床应用中具有潜在价值。

尽管早期的微阵列表达谱能够区分DLBCL的不同生物学亚组，但是它们不能鉴别单个基因的相关作用，因此很难依据相对较少的基因来建立有用的临床预后模型。

为解决这一问题，一些基于几个基因联合表达的预后模型被建议用来预测DLBCL患者的预后。Malumbers等建议用一种实时定量聚合酶链反应（Q-RT-PCR)方法建立的6个基因模型来预测DLBCL患者的预后，即通过对FFPE组织的6个基因表达分析得出结论：LM02、bcl-6和FN1与预后好有关，而CCND2、SCYA3和bcl-2与预后差有关。

基于这6个基因的表达，可将患者分为低危、中危和高危组，三组的5年总生存（0S)率从低危组的65%到高危组的15%，可看出具有明显差异。

该基因模型对0S的预后作用独立于IPI，但该预后模型要常规用于临床应用，需得到进一步验证，因为目前临床上不具备免疫组织化学所需的针对6个蛋白的所有单克隆抗体。

Alizadeh等提出了基于肿瘤生物标志物LM02和肿瘤微环境标志物肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)的双基因模型，LM02可作为GCB亚型的独立预后因素，TNFRSF9也是独立的预后因素，高TNFRSF9表达意味着预后差。

他们在多元分析中用该双基因分数（TGS分数）来评估预后，TGS高的患者预后相对不良，而TGS低的患者预后相对较好。

大量研究认为TGS是独立于IPI的预后指数，Alizadeh等进一步将TGS和IPI联合起来建立了TGS-IPI模型，根据TGS-IPI分数将患者分为高、中、低危组，2年无进展生存（PFS)率分别为98%、71%和42%；2年0S率分别为98%79%和51%，该模型比单独使用IPI或TGS进行危险分层效果更佳。

2012年，Bret等建立了基于12个基因表达的危险评分(GERS)，该研究显示GERS可以作为独立于IPI的预后因素，对CH0P或R-CH0P方案的DLBCL预后评估均有价值，根据GERS可将患者分为高危组和低危组，有学者进一步将GERS和IPI联合起来建立了GERS-IPI模型，将患者分为四组，其中第一组患者未达到中位生存期，其余三组中位生存期分别为109.3个月、27.7个月和8.5个月。GERS-IPI模型可能是有力的预后分类，且GEP中出现不稳定基因，即为GERS高危组。 

2DLBCL的免疫组织化学分型

根据GEP的不同，可将DLBCL分成具有不同预后的GCB亚型和ABC亚型（与IPI无关），并且反映了其潜在的分子生物学特性。

因此，GEP可以作为分型的金标准，但是基因芯片技术费用高，对样本要求高，所以大量免疫组织化学标记被用来代替GEP用于临床。

其中应用最广泛的就是Hans分类，Hans等在2004年用组织芯片（TMA)技术对DLBCL进行分型，用CD10、bcl-6和MUM13个标记，建立了一套反映GEP的免疫组织化学分型模式。

Hans分类中的GCB亚型5年0S率为76%，而non-GCB亚型为34%，其与GEP结果相对照有较低的一致性（71%的GCB-DLBCL和88%的non-GCB-DLBCL与GEP分型结果相类似），这表明需要其他的免疫组织化学标志物来提高该分类的预测准确性。

为进一步明确Hans分类中各标记物对预后的作用，Rayman等使用TMA技术对两组（年龄≥65岁和 65岁）采用CH0P方案的DLBCL患者进行分析，根据Hans分类将每组样本分成GCB和non-GCB亚型，结果显示两组预后差异无统计学意义，CD10和MUM1的强表达在两组中与预后均没有关系，bcl-2仅在年龄≥65岁组与PFS和无事件生存（EFS)差有关。

有学者进一步研究CD10、bcl-6和MUM1表达的临界值变化是否会导致更好的临床结果，结果显示三种标志物表达的临界值变化对结果预测亦没有作用。

由于Hans等免疫组织化学分型是反映西方人口的疾病分布，而西方人口中GCB亚型所占比例比亚洲人高，因此对于采取R-CH0P方案的亚洲人来说，DLBCL分子亚型对其治疗结果的预测作用仍有待研究。

Xia等根据Hans分类将108例中国DLBCL患者分成GCB和non-GCB亚型，分析该分类中不同亚型对DLBCL患者的预后作用，结果显示对于采取CH0P方案的患者，GCB亚型的完全缓解（CR)、3年PFS和0S均明显好于non-GCB亚型；而对于采取R-CH0P方案的患者，GCB和non-GCB亚型间的预后差异无统计学意义。

研究结果提醒我们Hans分类适用采用CH0P方案的患者，其对GCB和non-GCB亚型预后的判断对于R-CH0P方案的患者表现出了不一致结果，因此临床上根据Hans分类来进行DLBCL亚型分类及预后判断时需谨慎。

Muris等分类使用3种分子标志物：bcl-2、⑶10和MUM1，与Hans分类相比较，Muris分类中未使用在染色技术上较难、其结果的判断也缺乏统一标准的bcl-6，而采用bcl-2作为标志物，bcl-2是一种抗凋亡蛋白，在利妥昔单抗时代，bcl-2蛋白的表达和其对DLBCL患者预后的影响存在很多争议。

一些研究认为在标准化疗方案基础上加用利妥昔单抗消除了bcl-2对预后的不利影响另外一些研究显示在non-GCB亚型中bcl-2仍然是不利的预后因素。

新的Choi和Tally分类法对预后有着更加准确的预测性。Choi分类，是基于5种生物标志物作出的分类:CD10、bcl-6、MUM1、FOXP1和GCET1，与Hans分类相比，Choi分类加人了2种新的分子:FOXP1和GCET1，其与GEP有很高的一致性(93%)，而Hans分类与GEP的一致性仅86%。

GCET1被认为属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，在DLBCL中与预后好有关，Montes-Moren?等发现GCET1相对特异性表达于生发中心B细胞，可以使用GCET1抗体来提高DLBCL中GCB和ABC亚型之间的区分。

FOXP1基因3p14.1编码一系列FOX家族的转录因子，FOXP1在ABC-DLBCL中高表达，有些研究显示高表达FOXP1与DLBCL患者预后差有关。

对采取R-CHOP方案的患者，Choi分类预测的3年OS率（GCB型为87%，ABC型为44%—与GEP分类的预测结果（GCB型为92%,ABC型为44%—相近，研究显示高IPI评分和Choi分类中ABC亚型均是总体生存率差的标志，同时Choi分类也可以评价未分类DLBCL的预后。

Choi分类比Hans分类更加准确，并且有助于DLBCL患者的危险分层。美中不足的是Choi分类虽与GEP—致性较高，但其实用性较差，因为该分类需5种抗体，其中2种（GCET1和FOXP1—在很多免疫组织化学实验室不常用，同时bcl-6在染色技术上较难，其结果的判断也缺乏统一的标准。

Meyer等报道的Tally分类与GEP有很高的一致性（93%—，也基于5种标志物：CD10、GCET1、FOXP1、MUM1和LOM2，在Tally分类中所有抗体结果被认为与预测细胞起源有关（与抗体检测的顺序无关）。

尽管Tally分类与GEP一致性较高，对细胞起源有较好预测性，但也有缺陷:该分类中使用的3种抗体GCET1、FOXP1和LMO2在很多免疫组织化学实验室并不常用；由于有些肿瘤高背景或非特异性染色，对GCET1、FOXP1和LMO2结果的判断缺乏统一标准。

Guti!rrez-Garc a等为了明确Hans、Muris、Choi和Tally分类与GEP分类的一致性以及每个分类在预后方面的作用，对157例采取R-CHOP方案的DLBCL患者建立了组织微阵列和大量免疫组织化学标记，进而比较以上各种IHC分类与GEP分类的一致性，结果显示通过Hans、Muris、Choi和Tally分类的GCB-DLBCL与GEP分类的一致性分别为52%、70%、40%和54%，而ABC-DLBCL与GEP分类的一致性分别为85%、62%、84%和80%。

以上各种免疫组织化学分类中的GCB和ABC亚型间的CR、PFS、OS差异均无统计学意义，而GEP分类中GCB和ABC亚型间CR差异也无统计学意义，但两亚型间PFS、OS差异有统计学意义（5年PFS率:76%和31%;5年OS率:80%和45%—。

研究结果与很多支持IHC分类和GEP分类在预后方面有良好相关性的研究相矛盾，导致这种差异的原因很多，包括研究对象的差异性和试验方法的不同等。

由于有研究结果显示Hans、Muris、Choi和Tally分类与GEP分类的一致性以及每个分类在预后方面的作用不是很理想，Viscol等使用5种标志物CD10、GCET1、FOXP1、MUM1和bcl-6来描述成熟B细胞的连续分化阶段，选择其中的CD10、FOXP1和bcl-6三种标志物来进行了分类，称之为Visco-Young分类。

他们对431例DLBCL患者进行各种免疫组织化学分类，结果显示Hans、Choi、Tally和Visco-Young分类结果与GEP分类结果一致性分别为87.3%、90.1%、90.1%和92.6%，同时该分类具有很强的独立预测预后价值(几乎与GEP预后分析结果一致—。

由于bcl-6的染色有很大可变性，不同实验室之间缺乏统一标准，在该分类中bcl-6的作用局限于CD10和FOXP1均阴性的一小部分患者（低于20%—，而Choi和Hans分类中bcl-6起的作用较大）分别对50%和60%的患者有用—。

Perry等最近试图通过免疫组织化学方法建立一个生物预后模型（BPM—，该模型结合了细胞起源和基质-1、基质-2的预后作用，模型中的3个参数（Choi分类、SPARC和MVD—在之前都被证明是很强的生存预测因素，其中每个不良预后因素得1分，根据评分将患者分为2组，0~1分为低分组，2~3分为高分组，研究显示低分组预后明显好与高分组，他们进一步将该模型应用于74例DLBCL患者，结果显示BPM评分对OS和EFS均有很好的预测作用。

该模型是在利妥昔单抗时代通过免疫组织化学方法将细胞起源和基质标志物联合在一起作为预后评分的第一个模型，与之前的各种基因预后模型相比较，该模型采取免疫组织化学的方法来评估DLBCL的预后，具有简单易行性等优点，但免疫组织化学标记和Choi分类的可重复性一直受到质疑，该模型中的微血管密度在很多实验室也不能进行评估，从而使其应用受限。

3 基于定量核酸酶保护（qNPA）技术进行的分类

由于根据GEP进行的DLBCL分子亚型分类需要提取RNA和新鲜冷冻组织等原因而在临床上使用受限，而Hans和Choi等免疫组织化学分类是基于对蛋白表达水平的半定量评估，Rimsza等试图用qNPA技术对FFPE的组织进行DLBCL分子亚型的分类，对121例采取R-CHOP方案的DLBCL患者进行12个基因的分析，结果显示通过qNPA技术分类的GCB、ABC亚型与GEP分类一致性分别为73%、79%，当把未能明确分类的患者排除在外后，其与GEP分类总体一致性可达92%。

值得注意的是，qNPA技术的不足之处在于，与IHC相比其相对复杂，且该技术中使用的12个基因微阵列目前还没有得到广泛的应用。

该技术的优势在于不需要提取RNA、使用FFPE、IHC结果加化。，在将来DLBCL的研究和临床试验中可能有潜在的重要影响，不仅与DLBCL分类有关，且可能与GEP数据的其他应用也有关。

4 miRNA与DLBCL分子亚型

DLBCL是一组异质性的B细胞淋巴瘤，积极寻找新的分子标志物对患者的诊断、治疗和风险评估具有积极意义，最近miRNA被认为在解释DLBCL的生物学和临床行为中起重要作用。

首先，miRNA的达与DLBCL分子亚型有密切关系，2007年Lawrie等用miRNA芯片技术分析DLBCL不同亚型中miRNA的表达谱发现，miR-155、miR-21、miR-221在ABC亚型中表达比在GCB亚型中增高；

其次，在大量研究中发现miRNA与DLBCL预后也密切相关，Alencar等针对176例采取R-CH0P方案治疗的DLBCL患者，分别测定了已报道过的11种在DLBCL中差异表达的miRNA，结果显示miR-18a的表达与患者的OS呈正相关，而mffi-181a、miR-222的表达与患者的PFS呈正相关，并且三者均可作为DLBCL生存率预测的独立预后指标。这些研究均表明，作为一类新的分子靶标，miRNA可作为DLBCL诊断和预后的分子标志物。

5 外显子测序与DLBCL

DLBCL作为高度异质性的恶性肿瘤，其最常见的为涉及3q27、18q21和8q24的bcl-6、bcl-2、myc基因的易位及扩增，然而免疫表型分型及各种遗传学异常对临床预后的指导意义仍存在很多争议。外显子是与疾病及表型相关的最具特征的区域，且由于不需要对非编码区测序而节约了大量人力、物力。

为了深人了解DLBCL的基因组学特征从而指导新的靶向治疗，Lohr等P对对55例DLBCL和正常组织进行了全部外显子测序，结果发现已知与DLBCL功能密切相关的频发突变基因包括MYD88、CARD11、EZH2和CREBBP;之前未被认为与DLBCL功能相关的体细胞突变基因包括MEF2B、MLL2、BTG1、GNA13、ALTB、P2RY8、PLLO和TNFRSF14。

Bohers等对参与BCR和NF-kB(CD79A、CD79B、MYD88、CARD11)途径或EZH2的激活基因突变进行了研究，发现L265PMYD88是MYD88最常见突变，并且仅在ABC-DLBCL中可见。CD79A/CD79BITAM区域仅在ABC-DLBCL可见，而CARD11突变在ABC和GCB两种亚型中均可见。

EZH2Y641置换几乎仅见于GCB-DLBCL，同时该研究发现突变基因激活了与ABC-DLBCL预后相关的NF-kB信号途径，这些结果提示结合信号抑制剂或者针对不同信号途径的靶向治疗成为可能。

目前DLBCL很多的突变基因对其预后的作用还不明确，Schif等对154例DLBCL患者进行了细胞因子抑制剂（SOCS1)全长的测序，结果发现SOCS1截断突变比非截断突变预后好。从这些外显子测序可以看出，各种突变基因可能对DLBCL发病机制、分型、预后及治疗策略有很大作用。

越来越多的研究之所以对DLBCL进行各种分子亚型的分类，是因为其不仅有助于对预后的判断，而且可能有助于各种亚型的靶向治疗。

但GEP应用受限，大量免疫组织化学技术被建议代替GEP，然而各种免疫组织化学分类也因其与GEP分类的差异性和其在DLBCL预后方面的作用存在很多争议，从而提醒我们在临床上需谨慎对待通过免疫组织化学技术对DLBCL患者进行危险分层进而指导治疗的临床应用。新技术如qNPA、miRNA及外显子测序或许在DLBCL的诊断、生物治疗及预后方面具有广阔的应用前景。

白血病.淋巴瘤2014 年5月23卷5期