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文章作者：孙洁文 胡成龙 章骏 李静

为确保骨髓的终身造血，造血干细胞（HSC）在不断分化生成造血祖细胞（MPP）的同时，还通过自我更新来维持其自身数量不变。这种HSC的自我更新依赖于其所在骨髓微环境（龛）的调控和维持。

全面揭示骨髓微环境调控HSC自我更新的机制不但为我们建立更有效的HSC体外扩增体系提供直接依据，同时将为探讨包括白血病和再生障碍性贫血等难治性血液系统疾病的发病机制提供重要信息。

一、HSC龛的组成和结构

在骨髓中，除造血细胞外，还存在着由毛细血管窦组成的毛细血管网、骨髓内骨架组成的骨小梁网、各种间质（网状）细胞组成的间质细胞网和交感神经等组成的神经网络。

这些网络相互交错形成一种蜂窝状结构充满整个骨髓腔，造血细胞填充于这种蜂窝状结构的空隙中。所以，造血细胞在骨髓中并非处于一种自由流动状态，而是被上述网络结构限制在一定空间内，以灶状造血结构的形式存在。

每个造血灶作为一个造血单位，含有包括HSC、MPP和各种定向分化造血祖细胞以及成熟细胞。血管内皮细胞、成骨细胞、间质细胞和神经细胞等除为造血细胞提供特殊的接触表面外，同时还产生细胞外基质（ECM）成分和造血生长因子，为造血细胞提供生长所需的活动空间和营养成分。

研究表明，骨髓中可能存在着两种HSC 龛，即骨内膜成骨细胞龛和毛细血管周围血管内皮细胞龛。前者主要由成骨祖细胞、基质细胞和破骨细胞等组成，而后者主要由血管内皮细胞和血管外周基质细胞组成。

研究发现，血管内皮细胞龛多靠近骨表面，并与成骨细胞龛分享某些细胞或基质成分，如间充质干细胞（MSC）、网状细胞和Schwann 细胞等，此外巨噬细胞和脂肪细胞也可能分布于两种龛中参与HSC功能的调控。

近年来的研究表明，血管内皮细胞龛可进一步分为动脉血管龛和静脉血管龛。动脉血管龛主要位于富集骨小梁的骨垢段靠近骨膜的区域。这也可能是为什么在股骨和胫骨等长骨中，HSC 多集中在骨干两端的富含骨小梁的骨髓腔中的原因。此外，也有研究结果提示，位于动脉血管龛和成骨细胞龛的HSC均处于相对静止状态，对维持造血的动态平衡起关键作用。

二、龛细胞对HSC的调控

1. 成骨细胞和血管内皮细胞对HSC的调控作用：

最近，Ding 等研究发现，从血管内皮细胞和血管周围基质细胞中剔除SDF1 会引起HSC 的明显减少，而从成骨细胞中剔除SDF1 可引起淋巴细胞祖细胞的明显减少而不引起HSC 的改变，因此认为血管内皮细胞龛是真正的HSC龛, 而成骨细胞龛为淋巴细胞祖细胞的龛。

小鼠模型研究表明，血管内皮细胞龛和成骨细胞龛均对维持正常造血的相对稳定至关重要。任何一个龛的受损都会造成造血组织的紊乱甚至疾病的发生。

如Walkley 等在Rb（Retinoblastoma）基因或RXR基因剔除小鼠研究中发现，成骨细胞龛的受损将引起HSC 增殖和分化的过渡活跃，导致小鼠骨髓增殖性疾病（MPD）的发生，表现为某一系或多系骨髓细胞不断地异常增殖。

2010 年Raaijmakers 等在成骨祖细胞特异性Dicer1剔除小鼠中发现，由于成骨细胞龛的严重破坏引起HSC 和造血祖细胞凋亡的增加，从而导致小鼠骨髓增生异常综合征（MDS），表现为骨髓细胞增生活跃，但外周血或全血细胞减少，其本质是无效造血导致造血细胞数量和质量不可逆转的下降，甚至导致白血病的发生。与此相反，在血管内皮细胞龛破坏时，由于HSC增殖和生存受到抑制，多引起骨髓中HSC的数量减少和造血组织的萎缩。

2. MSC及各种基质细胞对HSC的调节作用：

在骨髓中存在MSC和HSC两种干细胞。MSC的含量非常少，不到骨髓细胞的0.01%，多位于骨内膜区和毛细血管窦周围，是成骨细胞和所有骨髓基质细胞的祖细胞。过去，由于缺乏识别MSC及其分化的子代细胞的特异性标志，对MSC和HSC之间的关系缺乏直接证据。

近年来多项研究表明，HSC直接与SDF1 高表达的网状细胞、位于毛细血管周围的具有成骨功能的间质细胞祖细胞、nestin +CD51+ CD140a/b + 的MSC、CD146+，SMA+或NG2+的周皮细胞（pericyte）直接接触。

虽然这些间质细胞之间的关系如何尚需进一步深入研究，但根据它们均具有成骨、成纤维和成脂肪等多潜能分化特征提示它们可能为MSC或拥有多项分化功能的基质祖细胞。从骨髓中清除这类基质细胞可严重损伤HSC的功能和造血衰竭，提示它们在HSC 功能调控中的重要作用。

事实上，正如HSC可分化产生全部各系列造血细胞一样，MSC通过一系列命运抉择和分化后可产生包括成纤维细胞、成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞在内的所有骨髓间质细胞和骨组织。

HSC和MSC及其子代细胞在维持正常造血的动态平衡和造血重建中相互依赖缺一不可。研究表明，HSC与MSC共同定位于骨髓的成骨细胞和血管内皮细胞龛中。

体内、体外实验均证实MSC通过分泌特异性的造血细胞因子，如SCF和SDF1等调节HSC的功能。正如HSC 为非均一体一样，骨髓中也同时存在多种MSC。

如Tormin 等发现，CD271 + CD146 + 和CD271 +CD146-/lo两种MSC分别定位于血管窦和骨内膜周围，可能分别为血管内皮细胞龛和成骨细胞龛的主要成分在造血调控中起到不同作用。

Kunisaki 等发现，动脉血管的周皮细胞和静脉血管的周皮细胞分别表达NG2/SMA/Nestinbright和LEPR+/Nestindim，可能为两种MSC，这决定了动脉和静脉血管龛在HSC 调控中具有不同作用。

研究表明，动脉血管龛位于骨内膜区，维持HSC的相对静止状态，而静脉血管龛促进HSC 的自我更新和增殖、维持日常造血重建。当动脉血管龛受损时，位于其中的静止状态的HSC 将被动员到静脉血管龛。

此外，MSC通过一系列的分化过程生成各个分化阶段的成骨细胞。其中只有那些梭形的N-cadherin + 和osterix+ osteocalcin-的早期成骨祖细胞可能为成骨细胞龛的主要成分，而那些卵圆形的osterix-osteocalcin+的晚期成骨细胞可能已失去造血调节功能。

3. 神经细胞和神经递质对HSC的调节：

正常情况下，总有小量HSC 从骨髓的龛中被动员到外周血中，而在外周血中的HSC 也可回到骨髓龛中填充龛中丢失的HSC，这种HSC在龛和外周血间的交流受昼夜节律的调控。

Méndez-Ferrer 等发现去甲肾上腺素按照昼夜节律分泌，作用于基质细胞上的β肾上腺素受体，调节龛细胞释放的SDF-1 的剂量，从而使得哺乳动物在休息状态下将HSC从骨髓龛中释放到外周血中。

最近研究显示，包裹交感神经的无髓鞘施旺细胞（nonmyelinating schwann cell）作为骨髓龛中的另一重要组成，其与HSC直接接触，通过分泌TGF-β而维持HSC的休眠状态。

另外，小鼠和人类HSC均表达大麻素受体CB1 和CB2，而骨髓基质细胞分泌神经递质大麻素。Jiang 等通过研究敲除CB2 受体基因的小鼠发现，大麻素通过CB2 受体调节HSC 的动态平衡，在造血重建中起到重要作用。这些发现提示神经内分泌在正常造血调控中也起到重要作用。

4. 破骨细胞，巨噬细胞和脂肪细胞对HSC的调节：

破骨细胞是骨髓成骨细胞龛中重要的成分。它通过调节骨组织的重塑而调控成骨细胞龛的形成和重建，从而参与HSC 的功能活性的调节。

2011 年，Lymperi 等利用二磷酸盐处理小鼠发现，由于诱导破骨细胞的大量凋亡而引起骨髓龛的改变，使HSC由于失去正常龛的调控而分化，其骨髓中HSC明显减少。

同年，Mansour 等通过研究oc/oc 小鼠发现，由于破骨细胞的缺失会发生骨硬化病，在这种小鼠的骨髓中，MSC向成骨细胞分化障碍而导致Ter119-CD45-Sca1+CD140a+MSC在血管周围积累和HSC成骨细胞龛的形成缺陷，引起HSC功能和数量的异常。

巨噬细胞可能参与HSC的维持。最近Winkler、Chow等的研究结果显示，通过粒细胞集落刺激因子（G-CSF）注射、负载了氯磷酸盐的脂质体处理或者Fas 激活等特异性诱导巨噬细胞的缺失，可引起nestin+MSC和骨内膜成骨细胞产生的与HSC维持相关的因子例如SDF1，SCF，Angiopoietin-1和VCAM-1 的减少，从而导致骨髓中HSC由于被大量动员进入血液而下降。脂肪细胞缺失型小鼠的相关研究表明，脂肪细胞被证明是骨髓中重要的HSC负调控因子。

Naveiras 等的研究结果显示，在受到放射等所致的骨髓损伤后，脂肪细胞缺失型小鼠HSC的增殖和造血重建速度明显快于对照组。

正如人们所知，随着年龄的增长，骨髓中的脂肪细胞明显增加，在老年人长骨，除两头骨垢段，骨干段骨髓充满了脂肪细胞。那么，这种现象是到底骨髓造血降低的原因还是结果，尚需进一步实验鉴定。

三、骨髓ECM对HSC的调控

骨髓ECM主要由骨髓基质细胞和造血细胞分泌的纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白I 和IV型、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素和粘多糖等组成的半固体胶冻状结构，其中富含调节造血的生长因子、细胞因子和金属蛋白酶等。骨髓中不同部位ECM的成分可能不完全相同。

这些基质成分通过与HSC表面整合蛋白（Integrin）、CD44等黏附分子受体直接接触而协助HSC在HSC龛中的定位和迁移，同时这种接触可能还刺激HSC中信号的活化，参与调节HSC的功能。

研究发现，MSC 和成骨细胞分泌的聚集蛋白（Agrin）通过激活HSC表面的受体α蛋白聚糖介导的骨髓中HSC和骨内膜处的成骨细胞的细胞间相互作用，拮抗骨桥蛋白的造血抑制活性，促进HSC 的生存和增殖。

在2011 年，Mazzon 等进一步研究显示，Agrin 剔除小鼠由于HSC凋亡增加而导致造血缺陷。此外，近年来研究发现，成骨细胞分泌的肌腱蛋白C（Tenascin-C）在骨内膜区域的成骨细胞龛中高度富集，虽然肌腱蛋白C对生理状态下的造血无关紧要，但它通过结合高亲和力的特殊整合蛋白（如Integrin-α9）促进HSC的增殖，对损伤后骨髓造血重建起重要作用。

四、细胞外因子对HSC自我更新的调控

目前认为，HSC自我更新可能是维持生存、防止衰老、阻止分化和促进有限增殖等多种信号作用的综合结果通过近年来的研究，陆续找到了一些潜在的参与调节HSC 自我更新的信号分子和转录调控因子。

1. 发育相关分子对HSC 的调控：

Notch、Wnt、BMP、Hedgehog 和FGF等诱导的信号通过诱导造血细胞的前体细胞和/或促进造血前体细胞向HSC分化，在胚胎早期的造血形成过程中起着至关重要的作用。骨髓基质细胞表达Notch配体Jagged1 和Wnt 配体Wnt3a 多可以促进HSC 增殖和维持HSC功能，为HSC的正调控因子。

Butler 等发现，Notch信号在血管内皮细胞作为滋养层的体外HSC扩增体系中起重要的作用。但是，Mailard 等关于DN-MAML转基因小鼠和CSL/RBPJ 剔除小鼠（经典的Notch 信号被抑制）和β-Catenin/γ-Catenin 剔除小鼠（经典的Wnt 被抑制）的研究报道表明，经典的Notch 和Wnt 信号对成体造血并非必不可少，因为这些小鼠的造血系统包括HSC 的数量和功能基本正常。

2. 造血细胞因子诱导的生存、增殖和分化信号对HSC自我更新的调控：

研究表明，SCF、TPO、CXCR12 是重要的HSC-龛因子。体外研究发现，许多造血细胞因子，如SCF、TPO、Flt3L、IL-11 和IL-3 等在有滋养层的培养体系中可诱导HSC的有限扩增；但在无滋养细胞的培养体系中，这些造血细胞因子并不能维持HSC 的自我更新，它们在促进HSC增殖和生存的同时诱导HSC向特定的造血祖细胞分化而使其逐渐耗竭。

体内研究发现，SCF 可能是维持和扩增HSC的关键因子，其信号失活将引起严重的造血功能障碍。

2012 年Ding 等研究表明，在成年小鼠骨髓中，nestin+间充质细胞、内皮细胞、成骨细胞和血管周围基质细胞以及部分造血细胞均表达SCF，但在内皮细胞和血管周围的基质细胞中剔除SCF 即可引起HSC 数量减少80%，提示这两种细胞中产生的SCF对HSC的生存和增殖起关键作用。

3. 炎性因子诱导的生存和死亡信号对HSC自我更新的调控：

大部分炎性分子，如TNF、IL-1b、IL-6 和IFN-γ等由于可同时诱导生存和死亡信号，对正常造血可能起抑制和促进双向作用。体外研究发现，这些炎性分子对HSC 的扩增具有明显的抑制活性，而抑制细胞凋亡可明显促进HSC 的体外扩增。

体内实验表明，TNF和IFN等动员HSC离开骨髓龛并抑制HSC的功能，在再生障碍性贫血和MDS疾病的发生和发展中起重要作用。

4. 应急信号和抗衰老信号对HSC 自我更新的调控：

炎性分子或应急信号刺激不但可以通过诱导细胞凋亡而抑制HSC的功能，而且还可以通过ROS（reactive oxygen species）的产生和刺激P38MAPK 应急信号而诱导HSC 的衰老。有文献报道，抑制ROS和P38 激酶的活性可通过防止HSC 的衰老而促进HSC的体外扩增。

5. 趋化因子和黏附分子信号对HSC 自我更新的调控：

HSC的正常功能不但取决于其自我更新、增殖和多功能分化能力，同时还受到其是否能够正确的找到并发挥功能的合适场所（归巢功能）并在这个场所中能够持续长久定居。

研究表明，这种归巢和定居功能由趋化因子如SDF1 和黏附分子如Integrin、CD44 和selectin 等诱导的信号调控。此外，趋化因子和黏附分子诱导的信号也可能参与调节HSC的生存和增殖。

六、展望

HSC自我更新的失调和多潜能性分化能力的异常是许多血液病发生和发展的根源。所以，对HSC 自我更新和多潜能分化能力分子调控机制的研究始终是干细胞领域的研究热点，对揭示白血病和再生障碍性贫血等血液病的发病机制及开发新药等均有重要意义。

综上所述，HSC自我更新能力是多种龛细胞、多个体外因子通过多种信号通路作用体现出的细胞生物学行为的综合结果。

鉴定可支持HSC扩增的龛细胞及其产生的信号分子，然后模拟体内骨髓龛的组成，建立能有效扩增HSC的体外龛，不但可能解决HSC移植治疗中HSC来源短缺的问题，而且能为研究HSC自我更新和多潜能分化的分子机制提供体外研究系统。

中华血液学杂志2014年6月第35卷第6期