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文章作者：杨蕾 李丽莉 王国治

世界卫生组织（WHO）于2010年12月提出一项关于结核病实验室诊断技术的建议⑴，该建议认可一种名为全自动核酸扩增试验（nucleic acid amplification test，NAAT）的全新结核病快速检测方法，认为这种检测方法可能对结核病的治疗和控制带来革命性变化，是全球结核病诊断和治疗方面的一个重要里程碑。

鉴于结核病基因诊断在目前我国的结核病研究与临床应用中具有重要作用，笔者研读了WHO推荐产品的相关研究背景资料，调研我国结核病基因诊断技术应用的现状，现将相关意见阐述如下，欢迎国内外同行提出批评与建议。

一、关于NAAT中Xpert?MTB/RIF检测系统的问题

该检测系统是一种商业化诊断试剂，使用者只需在独立反应孔中加人待检样品，通过核酸扩增检测系统，即可同步、快速检测MTB和利福平耐药。该方法不仅可区分MTB与非结核分枝杆菌，还能诊断结核病和艾滋病毒合并感染。

该系统集样品准备、核酸扩增和核酸荧光检测于一身，单次样品检测周期短，仅需约100min即可得出准确诊断，具有操作简单、生物安全性高的特点，可作为结核病及利福平耐药快速检测技术手段之一。

但该方法学的敏感度与其他基因扩增检测技术相比无明显优势，且仅能检测利福平一种药物，其技术水平和检测效果尚有待商榷。

1.Xpert?MTB/RIF快速检测方法评价：

文献报道，在对Xpert?MTB/RIF进行MTB检出能力的临床评价时仅以培养阳性(简称培阳）作为评判标准，得出的阳性检出率远高于以结核病临床诊断为评判标准的检出率，可能给人待检试剂高敏感度的假象，同时无法判断该方法能否改进目前菌阴肺结核检出率低的情况。

WHO在“2011年全球结核病控制报告”中对该试剂的评估结论为：单次Xpert?MTB/RIF检测可检出99%的涂片阳性（简称涂阳）和 80%的涂片阴性（简称涂阴）肺结核病患者。但文献报道，单次Xpert?MTB/RIF检测涂阴培阳样本的检出率分别为72.5%和76.9%。

由于涂阴患者包括涂阴培阳、涂阴和培养阴性（简称培阴）两种类型，而涂阴培阴患者的检出率必然低于涂阴培阳患者，因此，该报告中Xpert?MTB/RIF的MTB涂片阴性患者阳性检出率较实际值偏局。

根据该检测试剂公开发表的数据，该试剂的敏感度研究均以培养或涂片阳性作为判断标准，涂阳培阳样本检出率为99.8%，培阳样本的检出率也高达90%，具有高敏感度。

根据我国第5次结核病流行病学调査结果，以我国痰菌阳性（简称菌阳）患者占患者总数26.4%进行推算，该试剂的理论检出率仅为23.7%；我国结核病涂阴培阴患者占患者总数的73.6%，痰菌阴性（简称菌阴）结核病是诊断的难点，提高这类患者的检出率对我国结核病防治工作有着重要意义。

根据文献的数据，1462例疑似患者中有105例培养阴性的患者临床诊断为结核病。遗憾的是，该文献并未提及此类患者的检测结果，也未将其纳人敏感度和特异度分析。

从这方面看，Xpert?MTB/RIF检测试剂的阳性检出率低于人们对分子生物学诊断试剂高敏感度的预期值，更未对菌阴结核病患者进行评估，无法体现该试剂对此类人群检测的技术先进性与优越性。

此外，我国基因诊断试剂的临床评价结果显示，基因扩增技术的敏感度普遍高于培养法，但基因扩增阳性而培养阴性样本的诊断必须依据临床诊断进行认定，仅根据培养结果而不采用临床诊断结果，实际上无法完成临床评价。

Xpert?MTB/RIF临床方案在对临床样本培养结果的检测中，6个临床研究中心虽然均采用培养阳性为评价标准，但培养方法各不相同，秘鲁为单次BactecMGIT培养，南非为2次BactecMGIT培养，阿塞拜疆为1次BactecMGIT加1次改良罗氏培养基培养，乌干达为1次BactecMGIT和2次罗氏培养基培养，印度为单次罗氏培养基培养，而菲律宾采用1次BactecMGIT和2次Ogawa培养。

鉴于目前各种类型液体培养基的阳性率明显高于固体培养基，不同培养方法的阳性样本检出率也会发生变化。在临床评价中，同一试剂以液体培养还是固体培养作为评价标准，所得出的结论必然不同。而该试剂的临床方案采用几种不同方法，即在同一研究中采用不同的评价标准，这可能影响其评价结果的一致性与可靠性。

在文献的数据中，菌阳患者占87.6%(741/846，其中涂片阳性患者占75.7%，561/741），菌阴患者仅占12.4%(105/846）。

而依据我国第5次结核病流行病学调查结果，我国结核病患者中涂阳患者占14.4%(118/1310），菌阳（涂阳或培阳）患者占26.5%(347/1310），菌阴患者占73.5%(963/1310），菌阴患者比例远高于Xpert?MTB/RIF临床评价中的菌阴患者，提示文献报道的菌阴患者比例可能难以代表其实际比例。

体外诊断制品临床评价的研究对象应与试剂适用范围相一致，若临床研究的人选标准导致研究人群出现漂移，则该产品临床评价的真实性与可靠性将无法得到保障。

2.Xpert?MTB/RIFTB耐药快速检测方法评价：

结核病的耐药问题是控制结核病最大的难题，耐药结核病患者中有单耐药、耐多药和广泛耐药，近年来又发现全耐药结核病患者，早期、同步检测出多种耐药是快速耐药检测研究的方向。

该检测试剂用于利福平耐药检测，具有敏感度、特异度较高及检测时间短的优点，但该方法仅能检测利福平1种药物，对临床指导意义有限，且由于技术原因，该方法用于多种药物同步检测的难度很大。

由于耐多药结核病是由耐两种一线抗结核药物（异烟肼和利福平）的MTB菌株引起，而该试剂仅能检测利福平，如利福平基因检测阳性，提示患者可能为耐多药；检测阴性可排除耐多药，除此之外，该诊断结果并不能确定患者为耐多药。

目前已有多种商业化试剂可同时进行耐异烟肼和耐利福平的基因快速诊断，在此前提下，如依然重点推荐仅能检测单一耐利福平的检测试剂，是否不太合适？

对痰标本直接进行耐药检测可在最短时间内检出耐药结核病患者，从表面上看这是一种最佳方案，我国重大传染病专项课题也将其作为研究方向和评价指标，但直接对痰标本进行耐药检测尚有不足之处：

（1）根据最近的流行病学调查结果，我国结核病患者中痰标本涂片阳性的患者仅15%，如采用WHO推荐的另一种线性探针法诊断试剂（第1代耐多药MTB诊断试剂）对这部分患者进行检测，可致大量患者漏诊；

（2）痰标本的含菌量不一，大多数耐药检测试剂在含菌浓度为1000/ml时可出现假阴性或出现难以判断结果的现象，10000/ml的样品在耐药菌比例高达50%时方可检出耐药。

而目前实验室耐药评价指标以1%为耐药判断标准，因此使用痰液进行耐药检测，不仅存在样本量和可检测项目有限的问题，还面临含菌量较低时无法检出耐药的问题。

二、结核病基因快速诊断与耐药快速检测的有关问题及建议

目前WHO十分认可Xpert?MTB/RIF，并认为“这种检测方法可能对结核病的治疗和控制带来革命性变化，是全球结核病诊断和治疗方面的一个重要里程碑。

不同以往将正在使用或研发的结核病微生物学、免疫学和分子生物学诊断技术仅列出方法学名称的做法，WHO将尚未问世及验证的第2代商业化试剂Xpert列为2015年推广项目，这将对各国结核病控制部门制定政策及研究者的研究方向产生重大影响。对于结核病诊断及耐药检测策略，笔者尚有不同看法，现阐述如下。

1.改进检测技术不能从根本上解决结核病患者发现率低的问题：

（l）WHO和我国结核病控制部门均认为，落后的检测技术导致结核病患者发现率低。我国传染病重大专项课题将结核病快速检测技术列为重点项目，期望随着诊断技术的提高可以提高发现率。

不可否认，目前的结核病实验室检测水平确实有提高的必要，但就结核病基因诊断检测试剂而言，10年来MTB检测试剂的最低痰菌检出量约为100/ml，检测水平并无显著差异。

（2）我国结核病防治面临的最大问题是绝大多数结核病患者并未就诊。据我国第5次结核病流行病调査结果，1301例活动性肺结核患者中无症状者占43.1%(561/1301），有症状者占56.9%(740/1301），其中无症状的患者均未就诊，30.3%(394/1301）的有症状患者未就诊，265例接受过结核病相关检查，17.1%(222/1301）的患者未被诊断为肺结核。根据上述结果，该调查中未就诊患者占全部患者的73.4%(955/1301）。

（3）根据我国结核病患者的人群就诊分布特征，即使检测技术提高到能100%检出结核病患者，但由于仅有不到30%的患者就诊，所能救治的患者也是有限的。因此，让未就诊的患者主动就诊是提高我国结核病患者发现率的关键环节。

（4）鉴于此，建议我国加强公众健康教育工作，提高大众对结核病的警惕性，让疑似结核病患者知晓国家的结核病防治政策，尽早到结核病防治中心就诊。除此之外，更有必要在我国结核病高发与高感染地区采用主动筛查方式发现结核病患者，这样才能真正提高我国结核病的检出率，降低结核病感染率。

2.耐药检测现状及应对策略：

目前，WHO推荐的耐药检测策略均是早期诊断，即收集患者痰液后立即进行分析诊断，可同时获得结核病快速检测和耐药基因诊断结果。该方法可在患者就诊时得到耐药结果.对结核病控制无疑具有重要意义。

目前国内多家耐药基因检测厂家也采用痰标本直接检测，但敏感度较低，检测效果差，其原因主要为：（1）患者痰菌含量低，极易造成漏诊。按照我国已注册耐药检测试剂的实验室检测结果，绝大多数试剂的最低检出限约为10000/ml，低于该浓度时无法准确判断检测结果；

（2）耐药患者体内可能同时存在敏感MTB和耐药MTB，药敏试验比例法将含1%耐药MTB作为判断标准，而目前的基因诊断技术在样品含菌量低于10000/ml，浓度为25%以下时通常难以检出，因此在痰液中耐药菌比例不够高时可能导致漏检；

（3）Xpert?MTB/RIF仅能检测利福平耐药菌，而对耐多药、多耐药甚至广泛耐药患者而言，需要快速耐药检测的品种越来越多，在同一检测体系中，菌量不足可影响检测的敏感度，这也是目前耐多药检测技术难以用于临床的主要原因之一。

众所周知，液体培养技术的阳性检出率高于固体培养基，检出时间也相对较短，通常为4~14do考虑到结核病治疗周期至少半年，如采用液态培养后再行耐药检测，相比直接检测痰标本要延长2周诊断时间，但这对药物敏感或耐药结核病的治疗影响均较低，却能极大提高检测的敏感度。

为此，笔者建议在基因诊断前先进行液体增菌培养，再进行基因检测。痰液用液体快速培养技术进行增菌培养后MTB大量增加，不仅可以解决最低检出量的问题，还将同时进行多项耐药检测成为可能。鉴于目前进口液体培养基的价格较高，建议采用国产液体培养基或变色液体快速培养基。

3.临床评价标准选择的建议：

我国结核病诊断试剂临床评价多采用对结核病患者的检出率来判断敏感度，而Xpert MTB/RIF及其他试剂在国内外的临床评价则采用涂片或培养阳性为评价指标，该方法虽然表面上提高了敏感度，但并不能代表实际的阳性检出率，单纯以微生物学阳性结果作为判断标准有以下缺陷：（1）基因诊断阳性率通常髙于微生物检测结果，菌阴肺结核患者需要临床诊断进行判断；

（2）无论是涂片或培养采用的方法学不同，其阳性检出率也不同，“金标准”也就不标准；（3）我国菌阴肺结核占结核病患者总数的70%以上，仅以少数菌阳患者的检出率作为评价指标，既无法体现检测技术的进步，也难以体现评价本身的客观公正。

据此，笔者建议采用结核病临床诊断作为结核病诊断试剂敏感度判断的标准，并在此基础上分别分析各诊断试剂对涂阳培阳、涂阴培阳及涂阴培阴结核病患者的检出率。

4.有关耐药菌基因型和表型不一致的问题：

目前MTB已对多种抗生素产生耐药性，遗传学研究结果表明，MTB耐药性是基因突变的结果。一直以来，针对MTB产生耐药的分子机制和结核病耐药的基因诊断技术研究，主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因突变的检测方面。

微生物学法和基因诊断技术已用于结核病耐药临床诊断，其中微生物学法是公认的耐药检测金标准。在对耐药检测试剂进行临床评价时，均以微生物培养结果作为判定标准。

但实际上经常存在这种情况，即某药物的靶点基因有突变，而该菌株的微生物培养结果显示为敏感菌；或所有靶点基因均无突变，该菌株的微生物培养结果却是耐药。基因型和表型间是否具有关联性及有无因果性，尚需要大量试验数据来证明。

用基因诊断技术检测出有耐药基因时，患者的临床表现可能并不耐药。鉴于此，我们建议将采用基因诊断技术检测抗结核药物耐药性的试剂命名为该药物的耐药基因检测试剂，而非耐药检测试剂，以避免产生检出耐药基因即为耐药的错觉。企业可以在产品说明书中注明其产品检测基因位点的突变频率，以及与耐药培养的符合率，以提示医生该耐药基因产生耐药的可能性。

中华结核和呼吸杂志2014年1月37卷1期