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肿瘤监测

对于肿瘤细胞克隆演变的监测是如何做到减少肿瘤侵袭的呢？一个癌细胞克隆群落中的每一个突变共同组成了独一无二的突变信息“条形码”。无论肿瘤细胞是于原位死亡或是进入循环系统，它们的DNA都会释放入血液成为血浆DNA。如果循环肿瘤细胞DNA能够被富集并测序，那么这些信息就可以用于肿瘤动力学的评估（图4）。这一方法已经被用于骨肉瘤患者结肠或乳腺转移肿瘤细胞的检测。在这些案例中，循环突变DNA的诊断和定量检测需要已知肿瘤样本的测序信息。上述方法被广泛应用于非白血性白血病（例如，检测慢性髓性细胞样白血病患者的BCR-ABL易位信息）以跟踪治疗后白血病负荷或检查轻微后遗症。更令人激动的进展来自于测序领域，对血浆DNA直接测序以鉴别循环肿瘤DNA (ctDNA)的突变信息，使得巧妙有效地利用血液样本进行“液体活组织检查”成为现实。上述方法得以临床应用的潜力很大，举例来说，对于患者的某些或全部转移性病灶的多重突变或难以触及的转移性细胞突变的检查中，可以用到上述方法。有研究报道，PIK3CA基因的突变检测涉及到了上述方法，这种基因的突变存在于28至29%的转移性乳腺癌患者中。血浆DNA中PIK3CA基因的突变与血液中转移性肿瘤样本中PIK3CA突变同时存在。明确哪些突变在监测肿瘤负荷中具有足够的敏感性和特异性，是活组织检查ctDNA基因分型技术依赖的基础。

图2 等位基因突变的下一代测序技术

血浆样本的连续测序可用于监测不同肿瘤灶的动力学特征，也因此可作为肿瘤灶的示踪工具。最近的研究成果支持这一设想，研究发现可以通过连续ctDNA测序监测转移性乳腺癌患者的10个伴随突变，并且ctDNA的动力学特征改变也可以承载连接给予两种不同化疗方案治疗后患者的突变状况，针对不同亚克隆肿瘤灶的治疗方法会引起不同的结局。

ctDNA检测诊断方案的有效性决定于ctDNA可反应肿瘤演化的程度。日前两项研究显示对转移性结直肠癌患者经KRAS等位基因突变检查诊断后给予抗EGFR抗体药物治疗，至影像学检查证实为疾病进展的平均时间为21周，最长可达10个月。虽然仅是初步研究，这些结果仍然显示ctDNA分型有助于我们理解药物耐药性的产生，并在影像学证据出现以前，追踪新生转移性肿瘤灶，以便在肿瘤灶还较小时即进行治疗干预。这一方法的灵敏度和特异性还需要在代表性患者人群和不同临床表现的患者人群中加以鉴定。

治疗抵抗性的出现

如何理解并对治疗选择压力下肿瘤灶克隆演变作出药理学阐释是肿瘤学两大挑战，如何明确抵抗性产生的机制并发现抑制克隆演化的药物是治疗复发性疾病的关键。治疗前全身性基因组测序样本的采样，治疗完成时明确是否存在任何疾病灶的残留，以及如何准确判断复发时间是达到上述目的的关键（图4）。每一项付诸临床试验的合并伊马替尼的分子靶向治疗，开始时对治疗产生应答的患者会逐渐出现抵抗性。

图3 克隆组成随时间的衍化

基因组序列中隐藏着那些可驱动抵抗性产生的突变。这些突变经常存在于编码靶标蛋白的基因中，或者存在于编码抑制靶标的通路蛋白的基因中。虽然它看起来仅仅为靶向治疗描绘了一张惨淡的画面，但它也和新药研发仅仅捆绑在一起，这些新药往往是针对旧药抵抗性靶点而设计的，它提供了起抑制作用的旁路信息，帮助人们在药物抵抗力这一领域迎难而上，在这一领域将会取得类似于人类免疫缺陷病毒领域那样的进展。这一方法在睾丸癌和儿童白血病领域的试验中已经取得成功，这两种疾病的克隆复杂性不会对化疗成功产生障碍。对于肿瘤灶敏感性或抵抗性相关基因型的阐明，为明确药物联合方案在临床前和临床研究中有效性提供了前提和基础。

临床实践中的突变和克隆评估

克隆演变的分层模型分析显示，早期体细胞突变（干突变）往往在多个甚至全部克隆群落中得以延续，而后发突变往往只存在于某些克隆群落中（枝突变）。病理学相关的司机突变往往发生于早期，而更多繁杂的枝突变可作为癌症发展里程碑的参照。常见的司机突变的典型包括慢性髓细胞样白血病BCR 和ABL (BCR-ABL)基因间的异位，胰腺癌中KRAS基因突变的激活，多形性恶性胶质瘤EGFR的过度扩增以及胃肠道间质瘤中KIT基因功能失去性突变等待。枝突变也可能扮演司机突变的角色。大多数现今流行的癌症基因组诊断检测技术（如基于高光谱图像或桑格测序技术）是二元（存在或缺失）的且并未考虑到不同特征的肿瘤比例（突变或扩增异常）。大部分通用的突变检测技术无力处理克隆的信息尤其易于遗漏枝突变的细节。原则上，全基因组深测序可轻松得到所有肿瘤体细胞突变以及一些克隆结构的信息。事实上，样本和分析的需求是限制其仅处于试验研究范畴的瓶颈。

图4 血浆DNA可用于监测游离肿瘤细胞DNA

近期，克隆纯系分析应如何应用于实践？我们设想，在可预知的未来，临床基因组学实验室应为分析细胞克隆群落突变流行率提供靶标深测序范围，靶标集中于临床可“报告”的或癌症发展里程碑式的基因或突变。范例包括KRAS基因突变可作为结肠癌患者分层和抗EGFR抗体治疗的依据，司机突变条形码的血浆检测用于肿瘤监测，EGFR突变信息用于预测厄洛替尼或吉非替尼获益。当前的药物成本评估显示，应用靶标富集技术，对400至500个基因（约3 Mb的纯属序列）展开深测序的成本可控制在数百美金范围内，然而在某些区域，调控障碍和患者知情允许会某些程度上增加成本。

对药物研发和新药临床评价的影响

追踪癌症克隆演变的能力，无论是试验中还是临床上都可为药物研发提供新的途径。大部分在研药物都是针对细胞中表达的靶标，它们的遗传背景特征未知或仅部分明了。研究者正致力于阐明常用于药物开发中的细胞系的遗传特征，但对于大部分的种系相关DNA信息（这使得种系突变与体细胞突变难以区分）我们并不了解。同样，大部分肿瘤亚型的常见细胞系也不足以代表肿瘤患者体细胞突变的多样性。肿瘤的基因突变现象预示着这种基因可能成为潜在的靶向治疗通路，而通过治疗假说对患者个体进行分类以区分哪些是适应症患者，则是一件艰巨的工作。通过进化选择研究的观察，无论是对克隆基因亚型呈阳性或阴性的患者，都应着眼于最重要的信号通路给予治疗。这预示着对治疗抵抗性或敏感性患者进行克隆基因亚型测序绘图有重要的意义。

对于肿瘤的临床分子分析还处于婴儿期，其中一项原因可能是临床决策相关的分子临床信息需要多年的努力方能获得。在一些地区，正在发展中的或已经证实的检测方法的成本效益比与特异性突变有关。肿瘤克隆群落研究为肿瘤药物研发领域增添了浓墨重彩的一笔。生物标志物或分层方法需要细致的检查并合并克隆群落的监测，功能影像学以及基因组信息学相结合将会为其发展带来难得的契机。临床试验互动模式应予重组以便活组织检查与肿瘤学研究结合得更为密切。